飼料中的氨基酸 檢測(cè)方法包

杭州天釗科技有限公司

一. 儀器及試劑

儀 器：

1). 天平一臺(tái)（精度0.1mg）；

2). 恒溫水浴鍋一臺(tái)；

3). 容量瓶；

4). 試管（1.5×15cm或1.5×10cm）；

5). 微量進(jìn)樣器（5ul或10µl）一支；

6). 微量可調(diào)移液槍?zhuān)?/span>1000ul）一支、吸頭多個(gè)；

7). 旋渦混勻器一臺(tái)；

8). HPLC系統(tǒng)及氨基酸分析柱（4.6×250mm）；

9). LC500梯度系統(tǒng)一臺(tái)

試 劑：

1). 超純水（≥18MΩ?cm）；

2). 乙腈（HPLC級(jí)）；

3). 三水合醋酸鈉（分析純）；

4). 冰醋酸（分析純）；

5). 衍生試劑A和衍生試劑B溶液，至于冰箱保存（衍生試劑包對(duì)身體有害，用時(shí)請(qǐng)做好防護(hù)措施）；

6). 正己烷（HPLC級(jí)）。

二：樣品制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取飼料10-50 mg，置于25 mL具塞比色管中，加1.0 mol/L鹽酸10 mL，攪拌提取15 min，靜置10分鐘，將上清液過(guò)濾到100 mL容量瓶中，殘?jiān)?/span>1.0 mol/L鹽酸10 mL，攪拌3 min，重復(fù)提取兩次，合并上清液，收集濾液并加1.0 mol/L鹽酸定容至刻度，搖勻。

三. 流動(dòng)相的配制

流動(dòng)相A： 0.1mol/L醋酸鈉溶液（pH 6.5）：乙睛＝93：7

配制方法：準(zhǔn)確稱(chēng)取三水合醋酸鈉13.6g于1000ml水中，攪拌均勻，使之溶解，用冰醋酸或氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至6.5；準(zhǔn)確量取配制好的三水合醋酸鈉溶液465ml和乙腈35ml，混合均勻，抽濾過(guò)0.45µm濾膜； 

流動(dòng)相B：水：乙腈＝20：80

配制方法：準(zhǔn)確量取水100ml和乙腈400ml，混合均勻，抽濾過(guò)0.45µm濾膜；

四. 衍生化反應(yīng)

1. 對(duì)照品溶液的制備

17種氨基酸對(duì)照品溶液用水稀釋至原來(lái)濃度的1/10倍稀釋作為對(duì)照品。

17種氨基酸對(duì)照品溶液稀釋10倍后，各氨基酸的濃度為：

2. 供試品溶液制備

精密量取/稱(chēng)取供試品適量，并配制成相應(yīng)濃度的溶液備用。

3. 衍生步驟

1）將恒溫水浴鍋預(yù)熱至50±1℃；

2）分別將A、B兩種衍生試劑用稀釋劑稀釋至原來(lái)濃度的1/5倍；

3）精密量取上述對(duì)照品溶液1ml，置于試管中，加入稀釋后的A溶液0.5ml和稀釋后的B溶液0.5ml，搖勻；在50±1℃水浴中加熱45分鐘，取出，加入正己烷溶液1ml，振搖；并用孔徑為0.45μm有機(jī)膜過(guò)濾，放置30分鐘后，取澄清的下層液進(jìn)行分析試驗(yàn)；

4）供試品的衍生步驟與對(duì)照品相同；

五. 色譜條件

1. 色譜柱：Ultimate® AA，5μm，4.6×250mm；

2. 梯度程序：

流動(dòng)相A： 0.1mol/L醋酸鈉溶液（pH 6.5）：乙睛＝93：7

流動(dòng)相B： 水：乙腈＝20：80

T(min)                    A%                          B%

0.01                     100.0                      0.0

11                        93.0                      7.0

13.9                      88.0                       12.0

14                        85.0                       15.0   

29                        66.0                       34.0

32                        30.0                     70.0

35                         0.0                    100.0

42                         0.0                    100.0

45                       100.0                      0.0  

60                       100.0                      0.0

流　速：1.0ml/min

柱　溫：40℃

 波  長(zhǎng)：254nm

 進(jìn)樣量：5μl

 工作站記錄時(shí)間：60min

色譜圖：

六. 操作步驟和注意事項(xiàng)

1. 操作步驟：

1）設(shè)置柱溫40℃和流速1.0ml/min；

2）將A、B兩個(gè)通道用乙腈：水＝20：80排盡氣泡（如B通道的原存留液中不含緩沖鹽，則無(wú)需用乙腈：水＝20：80排氣泡），B通道用流動(dòng)相B再排盡氣泡；

3）用乙腈：水＝20：80（A通道）沖洗系統(tǒng)20min，以防止緩沖鹽析出；

4）A通道用流動(dòng)相A排盡氣泡，然后用流動(dòng)相A走基線30min，平衡色譜柱；

5）運(yùn)行一次空白梯度；

6）進(jìn)樣分析；

7) 分析完成后：

I）用乙腈：水＝20：80代替流動(dòng)相A，進(jìn)水樣（清洗自動(dòng)進(jìn)樣器），進(jìn)行梯度洗脫；

II）換90％乙腈沖洗色譜柱40min以上；

2. 注意事項(xiàng)：

1）進(jìn)樣分析：先進(jìn)對(duì)照品溶液，后進(jìn)供試品溶液；

2）緩沖溶液，隔天需重新配制；

3）防止緩沖鹽析出。

  氨基酸方法包，主要包括：